Приготовление бактериального гаптена

Дневная культура микробов на пластинках МПА в чашечках Петри смывается 4-5 мл 1%-ной уксусной кислоты. Смыв кипятят на водяной бане 30-60 минут, фильтруют через асбестовую вату, фильтрат нейтрализуют 20 %-ным веществом углекислого натрия в присутствии индикатора. Приобретенный гаптен в количестве 0,5 мл наслаивают на равный объем преципитирующей сыворотки, цельной либо разведенной в два раза. На Приготовление бактериального гаптена границе меж сывороткой и гаптеном возникает кольцо преципитата.

11. Реакция преципитации в агаре.

Реакция преципитации в агаре является одним из более чувст­вительных способов анализа растворимых антигенов. Она позволяет выявить число личных антигенов в исследуемой воды (к примеру, в бактериальных либо тканевых экстрактах) и произвести анализ антигенного родства отдельных Приготовление бактериального гаптена компонент в консистенции антигенов.

Для постановки реакции употребляют I %-ный агар, приготовленный на физиологическом растворе. Кропотливо профильтрованный вполне прозрачный расплавленный агар разливают в чашечки Петри слоем 0,5 см шириной. После застывания в пластинке агара при помощи железной трубочки вырезаются луночки поперечником 5-6 мм - одна в центре чашечки и 4-5 по окружности Приготовление бактериального гаптена на расстоянии 2 см от центральной. В цент­ральную луночку наливается сыворотка зайчика, иммунизированного исследуемым антигеном, а в периферические - раствор исследуемого антигена и сравниваемых с ним веществ. Чашечки помещаются в эксикатор с налитой на дно водой (для предупреждения высыхания) при комнатной температуре. Учет результатов реакции делается через 24, 48 и 72 часа.

Антитела из центральной Приготовление бактериального гаптена луночки и антигены из периферических диффундируют, навстречу друг дружке, и в участках, где создаются эквивалентные концентрации антител и антигенов, выпадает дугообразная полоса преципитации. Возникновение нескольких полос преципитации меж центральной и периферическими луночками показывает на наличие нескольких антигенных компонент в исследуемой воды. Если полосы преципитации, идущие от 2-ух примыкающих Приготовление бактериального гаптена луночек, соединяются, это ука­зывает на идентичность антигенов, содержащихся в этих луночках. Обоюдное скрещение полос преципитации свидетельствует о серологи­ческой неидентичности антигенов.

Реакция кольцепреципитации: 1 – опыт 2 – контроль Реакция преципитации в агаре

12. Реакция лизиса.

а) Реакция гемагглютинации. На незапятнанное стекло наносят пастеровс­кой пипеткой каплю гемолитической сыворотки (инактивированной в отношении комплемента Приготовление бактериального гаптена), рядом - другой пипеткой - каплю физиологического раствора. Потом в обе капли добавляют по I капле 4 %-ной взвеси эритроцитов барана (не касаться пипеткой капли сыворотки). При помощи бактериальной петли перемешивают добавленные эритроциты поначалу с физиологическим веществом, а потом с сывороткой (но не напротив!). Реакция склеивания эритроцитов (гемагглютинация) происходит исключительно в опытнейшей Приготовление бактериального гаптена капле. Она наступает резвее при легком покачивании стекла и аккуратном подогревании. В контрольной капле склеивания эритроцитов не происходит (потому что там отсутствуют антитела);

б) реакция гемолиза. На незапятнанное стекло наносят на расстоянии 1,5 см друг от друга две капли гемолитической сыворотки в разведении 1:300. На таком же расстоянии от 2-ой Приготовление бактериального гаптена капли наносят другой пипеткой каплю физиологического раствора. Во все три капли незапятанной пасте­ровской пипеткой добавляют по I капле 4%-ной взвеси отмытых бара­ньих эритроцитов. После чего в первую и третью капли добавляют по I капле комплемента (свежайшая сыворотка морской свинки) в разведении 1:10, а во вторую каплю заместо комплемента добавляют физиологичес Приготовление бактериального гаптена­кий раствор в том же объеме. После чего содержимое всех капель кропотливо перемешивают (перед каждым смешиванием петля должна быть прокалена и остужена). Для ускорения пришествия реакции стек­ла могут быть немного подогреты высоко над пламенем спиртовки либо в термостате 10 минут. Реакция гемолиза происходит исключительно в первой капле, в какой Приготовление бактериального гаптена содержатся все нужные для этого ингредиенты: эритроциты, антитела (сыворотка) и комплемент. Во 2-ой капле про­изойдет реакция агглютинации, потому что в ней имеются антиген (эрит­роциты) и антитела (сыворотка), но нет комплемента. В третьей капле (эритроциты + комплемент; никаких видимых конфигураций не произойдет.

Итог РПГА

Контроль Разведения сыворотки
1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:1640 1:1280
Степень Приготовление бактериального гаптена агглютинации

Вывод_________________________________________________________________________________________________________________________________________________

13. Реакция связывания комплемента. Разбор методики постановки РСК, определения рабочих доз антигена, комплемента, получения гемолитической сыворотки. Для постановки основного опыта РСК нужны последующие ингредиенты:

а) антиген, рабочая доза которого уже оттитрована;

б) исследуемая сыворотка;

в) комплемент, рабочая доза которого должна быть также оттит­рована:

г) гемолитическая сыворотка с Приготовление бактериального гаптена известным титром;

д) 3 %-ная взвесь отмытых эритроцитов барана;

е) физиологический раствор.

Антиген для реакции связывания комплемента готовится из соответственных микробов (микробов, вирусов) либо может быть неспецифическим (в реакции Вассермана – кардиолипиновый антиген). В связи с тем, что антиген может владеть антикомплементарным действием, перед постановкой опыта он титруется, т.е. устанавливается Приготовление бактериального гаптена его рабочая доза. Титром антигена считается такая доза последнего, которая не вызывает задержки гемолиза. Для работы берут дозу антигена, равную половине его титра.

Источником комплемента для РСК служит свежайшая (либо высушенная) сыворотка крови морской свинки. Титром комплемента именуется его малое количество, которое в присутствии рабочей дозы гемолитической сыворотки обеспечивает Приготовление бактериального гаптена полное растворение эритроцитов. Для постановки основного опыта берут дозу комплемента, увеличенную на 20-25% по сопоставлению с установленным титром.

Гемолитическую сыворотку получают иммунизацией зайчика эритроцитами барана. Титром гемолитической сыворотки именуется то макси­мальное разведение ее; которое, будучи смешано с равным объемом (0,5 мл) 10%-ного раствора комплемента, вполне гемолизирует 0,5 мл взвеси эритроцитов в течение Приготовление бактериального гаптена 1 часа при 37 °С . В основной опыт бе­рется сыворотка, разведенная до 1/3 собственного титра. Так, если титр сы­воротки 1:1200, то в опыт берется сыворотка в разведении 1:400.

Исследуемая сыворотка (т.е. сыворотка хворого) перед опытом инактивируется при 56 °С в течение 30 минут, чтоб исключить действие имеющегося в ней комплемента. В реакцию следует Приготовление бактериального гаптена брать сыворотку в разведении 1:5.

Все ингредиенты для РСК берут в дозе по 0,5 мл. Недостающее количество компонент доводят до обозначенного объема физиологическим веществом. Титрование ингредиентов создают намедни постановки реакции.


priglashal-pauk-v-gosti-muhu-5-glava.html
priglashayut-na-koncert-ezhednevnie-novosti-podmoskove-moskva-76-26-04-2013-c-8.html
priglashayut-prinyat-uchastie-v-mezhdunarodnoj-nauchno-metodicheskoj-konferencii.html